건강한 씨앗 알기, 종자의 활력검정 방법 < 산림생물연구

- 립수목원은 우리나라 자생식물의 종자를 수집 · 보존하고, 장기저장 기술 확보 및 DB 구축 사업을 진행하고 있으며, 웹을 이용하여 종자 정보를 국민들에게 서비스하고 있다. 수집된 종자를 대상으로 발아촉진법 구명, 종자휴면 유형 및 저장조건 탐색 등 국립수목원에서 하고 있는 다양한 특성연구 중 이번 9월호 웹진에서는 종자활력검정 방법에 대해서 소개 하고자 한다.
  
  TZ의 무색채의 용액에 살아있는 세포와 죽은 세포를 넣었을 때 살아 있는 세포만이 접촉반응을 일으켜 붉은 색으로 염색된다. 그러므로 염색이 되고 안 됨은 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분하는 기준이 된다. 따라서 이 방법은 종자가 너무 작아서 절단이 어렵거나 참나무류와 같이 TZ용액의 염색을 방해하는 효소를 가진 종자에는 적합지 않고 농업의 곡류나 채소, 화훼종자와 목본류의 식물종자에 적합한 방법인데 특히 깊은 휴면성을 가진 목본류 종자는 발아시험에 의한 활력검정에 장기간이 소요되기 때문에 이 방법의 적용이 아주 효율적이다. 그러나 검정 기술이 복잡하고 해석이 어려워 실제 실행에는 많은 어려움이 있다.
  - 검정 작업전에 주의사항
    1. 1) 어떤 종자에 대하여 검정을 시작하기 전에 TZ용액의 침투가 용이 하도록 적당한 처리가 있어야 하는데 단단한 껍질을 가지고 있는 종자는 특별한 처리를 하여야한다.
    2. 2) 관찰 조사를 위하여 조직을 노출시킬 필요가 있는 경우에는 염색 형태가 파괴되지 않도록 조심하여야 한다.
    3. 3) 식물종에 따라서 검정작업을 위한 손질이나 준비, 흡수양식, 절개, 평가에 있어서독특한 방식이 있다는 것을 주지하여야 한다.
    4. 4) 국제종자검정연합회(ISTA, 1999)의 국제종자 검정기준에 들어있으며, AOSA (1995)의 종자검정을 위한 국제규정에도 포함되어 있다.
    5. 5) 본 검정기술의 핵심은 종자의 유형을 건전종자(Viable), 죽는 종자(Dying), 죽은종자(Dead)의 범위를 확정하여 인식하는 것이다.
  - ISTA기준에 의한 TZ 검정방법
    1. <1단계> 검정할 종자를 무작위로 추출한다. 준비작업으로 건조된 부분절개, 열기, 벗김, 차후 절개를 위한 물속에서 부분절개 등의 작업을 종자의 종류와 검정목적에 따라서 실행 한다.
    2. <2단계> 종자를 절개하면 곧바로 내부를 관찰하여 비립, 충해립, 부분적손상립 인지, 아니면 건전한 종자인지를 관찰하여 그중 가장 건강한 종자만을 선정한다.
    3. <3단계> 검정을 위하여 선정된 종자를 2.3.5 프리페닐 테트라졸리움(Triphenyl tetrazolium 0.1～1.0%의 무색 용액안에 선정된 종자(또는 배)를 30℃에서 배양한다. .
    4. <4단계> 종자의 염색상태에 따라 다음과 같이 구분 판정한다
  EE 검정은 종자의 활력 여부를 판단하기 위하여 실시한다. 따라서 이방법은 검정할 종자를 준비하고 종자로부터 추출한 배를 양호한 생육조건에서 배양하여 배의 상태에 따라서 생존, 생장, 부패의 증상을 결정하고 종자의 활력여부를 판단한다. 따라서 단단하고 신선한 상태로 남아 있거나 굵기나 길이가 불어나고, 녹색화 되거나 유근 및 떡잎 등이 발생하는 것은 활력을 유지하고 있는 것이며 부패의 증상을 보이는 것은 활력을 상실한 것이다. TZ 검정과 마찬가지로 EE검정은 6~8주 정도의 발아 촉진처리를 필요로 하는 휴면이 깊은 목본류 식물종자에 특히 유용한 방법이다. 그러나 종자가 너무 작아서 절개가 어렵거나 호두나무류와 같이 종피가 단단하고 배가 나선형으로 꼬여 있어 배를 완전하게 추출하여 내기 어려운 종자에는 적용이 안되는 방법이다.
  - ISTA기준에 의한 TZ 검정방법
    1. <1단계> 검정할 종자를 임의 추출하고 가능하면 건조한 상태에서 종자를 절개하여 배를 추출하며 그것이 불가능한 경우에는 해부가 용이하도록 물에 적신 다음 배를 떼어낸다.
    2. <2단계> 종자가 절개되면 ISTA기준에 의거 내부 조직을 조사하여 조직이 완전하고, 잘 발달되어 있으며, 건강한 것으로 판단되는 것에 대하여만 3단계 검정작업에 들어간다.
    3. <3단계> 충분한 수분공급과 환기가 잘 되는 상태에서 20℃의 온도에 7~14일간 배를 배양한다.
    4. <4단계> 배를 생존(survival), 생장(growth), 발달(development), 부패(decay) 상태로 구분하고 다음 기준표에 의거 판정한다.
  대부분의 난초과 식물종자는 그 길이가 0.1～0.2mm의 적은 종자이기 때문에 테트라졸린의 염색방법으로는 활력검정이 어려워서 형광지 시약검정(Fluorescein diacetate assessment)을 실시한다.
  - 실행방법
    1. 1) 열개된 꼬투리로부터 얻어진 난초과 식물의 종자는 RH15%, 15℃에서 종자함수율이 평형이 될 때까지 건조 시킨 후 밀봉된 용기에 넣어 보관하기 때문에 검정을 위하여 물을 흡수 시켜야 한다.
    2. 2) 분의 흡수는 20℃에서 증류수로 3시간 동안 침적 처리하며, 그다음에는 상업용 표백제 10%용액에 20분간 담그어 표백시킨 후 소독한 증류수로 3번 씻어서 사용한다.
    3. 3) 수분이 흡수된 배(종자)는 물을 떨어트려 놓은 현미경 슬라이드(유리판)에 넣고 그 위에 또 하나의 다른 현미경 슬라이드를 덮어 놓는다. 그리고 그 슬리이드를 부드럽게 회전시켜 엷은 막 형태의 외종피를 뚫고 배가 밖으로 나오도록 한다.
    4. 4) 순수 아세톤(absolute acetone)0.5%(w/v)를 준비하여 슬라이드 유리판에 있는 배와 1 : 1로 넣어 섞는다.
    5. 5) 염색은 일반적으로 6시간 정도 놓아두어야 되며 100배 배율의 현미경의 UV광선6) 활력이 있는 종자는 형광빛으로 밝게 보이고 활력이 없는 종자는 검고 어둡게 보인다.
  대부분의 난초과 식물종자는 그 길이가 0.1～0.2mm의 적은 종자이기 때문에 테트라졸린의 염색방법으로는 활력검정이 어려워서 형광지 시약검정(Fluorescein diacetate assessment)을 실시한다.